幾種蛋白質(zhì)含量測量方法比較
來源： 本站 類別：實用技術(shù) 更新時間：2010-08-31 閱讀次
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幾種蛋白質(zhì)含量測量方法比較
蛋白質(zhì)含量測定一直是生物化學(xué)中最常用、最基本的分析方法之一。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。機(jī)體每個系統(tǒng)都有蛋白質(zhì)的參與，蛋白質(zhì)占人體重量的16.3%。人體的蛋白質(zhì)主要來源于食物：豆制品、肉類或者奶粉等副食品。既然蛋白質(zhì)都來自于食物，那么測定食物中的蛋白質(zhì)含量就變得很有必要。
蛋白質(zhì)含量測定有好多種方法，歸納起來為：凱氏定氮法、雙縮尿法、Folin酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法。不同的方法，原理、步驟和實驗試劑都各不相同，但是一直以來，凱氏定氮法最為經(jīng)典，使用最為廣泛。近幾年，根據(jù)蛋白質(zhì)測定的凱氏定氮法，很多廠家已研制出了相應(yīng)的儀器，如：蛋白質(zhì)測定儀。蛋白質(zhì)測定儀測出的蛋白質(zhì)含量，包括其他非蛋白含氮化合物，如游離氨基酸、尿素等物質(zhì)，因此該儀器有時又被叫做粗蛋白測定儀。
下面我們列表來對各種蛋白質(zhì)含量測定方法進(jìn)行比較。
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方法 |
靈敏度 |
時間 |
原理 |
干擾物質(zhì) |
說明 |
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凱氏定氮法 |
靈敏度低，使用于0.2-1.0mg氮，誤差為±2% |
費(fèi)時，8-10小時，但如果采用凱氏定氮儀，縮短時間至4個小時 |
將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨氣，然后用酸吸收滴定 |
非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） |
用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測定，干擾少，如果采用凱氏定氮儀，就會大大縮短定氮時間 |
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雙縮尿法 |
靈敏度低，1-20mg |
中速20-30分鐘 |
多肽鍵+堿性Cu2+紫色絡(luò)合物 |
硫酸銨：Tris緩沖液，某些氨基酸 |
用于快速測定，但不靈敏，不同蛋白質(zhì)顯色相似 |
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Folin酚試劑法 |
靈敏度高，<5微克 |
慢速40-60分鐘 |
雙縮尿反應(yīng)，磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 |
硫酸銨，Tris緩沖液，甘氨酸，各種硫醇 |
耗費(fèi)時間長；操作要嚴(yán)格計時；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 |
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紫外吸收法 |
較為靈敏，50-100微克 |
快速5-10分鐘 |
蛋白質(zhì)中的絡(luò)氨酸和色氨酸殘基在280nm處德 光吸收 |
各種嘌呤和各種核苷酸 |
用于層析柱流出液的檢測，核酸的吸收可以校正 |
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考馬斯亮藍(lán)法 |
靈敏度最高，1-5微克 |
快速5-15分鐘 |
考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時，其λmax由465nm變?yōu)?95nm |
強(qiáng)堿性緩沖液，TritonX-100SDS |
最好的方法，干擾物質(zhì)少，顏色穩(wěn)定，顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 |
由上表可知，考馬斯亮藍(lán)法和Folin酚試劑法靈敏度最高，比紫外吸收方法高10-20倍。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜，但是精確度較高，因此作物蛋白質(zhì)測定的標(biāo)準(zhǔn)方法，而蛋白質(zhì)測定儀的發(fā)明，更是推動了凱氏定氮法的發(fā)展。我們在選擇何種方法測定蛋白質(zhì)含量時，應(yīng)該根據(jù)實際情況，從下面幾個點考慮：1.實驗堆測定所要求的靈敏度和精確度。2.蛋白質(zhì)的性質(zhì)3.溶液中存在的干擾物4.測定時間。從以上四個方面綜合考慮，最后選擇最合適的測定方法。
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